应用说明

细胞裂解物-蛋白质，SDS-CGE

用悟空Peregrine高效毛细管电泳（HPCE）的免标记内成像（LFII^®）技术分析大肠杆菌裂解物

从生物分子生产中的常规质量控制程序到生物标志物的发现和诊断，具有分析生物分子复杂混合物的高精度、良好的重现性和定量指标的分析仪器受到了广泛的追捧。

本说明描述了利用悟空HPCE的Peregrine系统和专有的LFII^®技术，对大肠杆菌细胞裂解液中四种最丰富的蛋白质进行高分辨率分离和随后的分子量表征。该方法提供了峰迁移率（<1%RSD）和峰面积（<5%RSD）的高质量的可重复数据。

简介

细胞裂解物样品的分析是鉴定蛋白质产物的表达、分子量、数量和纯度的必要条件。另一个常规程序是分析细胞在生长过程中受到挑战时蛋白质的上下调节。其他应用包括鉴定药物毒性、疾病状态或疾病易感性的潜在生物标志物。

分析复杂的蛋白质混合物，如裂解物，通常需要使用荧光或化学标记，因此需要专门的实验设计。对带有这些大标记的蛋白质进行分析会导致其特性的变化，如变形或迁移，从而导致特征化过程中的其他错误。

实验证明，悟空HPCE的Peregrine系统能够在仅使用nL样品的情况下，对来自粗细胞裂解物的复杂蛋白质混合物进行免标记分析。

材料和方法

蛋白质标记物和大肠杆菌样品溶于贝克曼样品缓冲液、水和ß-巯基乙醇中，在95℃下加热5min，在冰上冷却至室温。随后微离心2min脱气，转移到小瓶中，装在HPCE进样盘上。

电泳分离在贝克曼缓冲液中进行。缓冲液在使用前通过0.2 μm过滤器并在真空下脱气。样品注射条件为在5kV电压下电动注射15s，然后在16kV电压下运行。分离在内径为50μm，分离长度为22 cm，总长度为34cm的裸熔融石英毛细管中进行。

在分离过程中，仪器保持在25°C。在两次操作之间，用一种专有的冲洗方法，是用无菌水冲洗2min，再用运行缓冲液冲洗10min。随后检查连续性。所有检测均在214nm处进行，带宽为a±7nm。

结果

使用悟空HPCE的等相位顶点算法（EVA）和通用分离变换（GST）算法进行分离分析。GST是一种以自然方式组合来自512像素的数据方法，保留电泳峰形信息的同时使信噪比最大化。通常情况下，与单个电泳图相比，使用GST观察到的信噪比增加了10倍。EVA是一种优化分辨率的技术，并以无偏的方式从峰值高度而不是区域建立量化分析，并最大化信噪比。

蛋白质的单像素原始电泳图、GST和EVA处理数据如图1所示。EVA、GST和RAW之间的交叉引用可用于优化从分离中收集的数据。

图1 蛋白质标记梯度的原始、GST和EVA数据比较图

对由溶菌酶（14.4 kDa）、胰蛋白酶抑制剂（21.5 kDa）、碳酸酐酶（31 kDa）、卵清蛋白（45 kDa）、血清白蛋白（66.2 kDa）、磷酸化酶B（97kDa）、ß半乳糖苷酶（116kDa）和肌球蛋白（200kDa）组成的标准蛋白标记梯度进行分析，以显示HPCE Peregrine系统的重现性（见表1和表2）。

表1 蛋白质标记梯度n=10的峰迁移时间的重现性

表2蛋白质标记梯度n=10峰面积数据的重现性

将蛋白质梯度分离得到的数据绘制成校准曲线（见图2），用于测定大肠杆菌细胞裂解物。良好的再现性主要取决于系统的稳定性，众所周知，这取决于非常先进的热管理系统。

图3 细胞裂解物样品进行9次试验，显示出良好的Peregrine重现性

选择的四个主要峰迁移时间分别为13.40、17.19、19.54和19.83min，其对应的分子量分别为14.4、32.7、54.4和57.8kDa。

为了确定分离的重现性，蛋白梯度和大肠杆菌裂解物连续进样6次。分析后的数据用“镜像图”表示（图4），此图显示了6个大肠杆菌裂解物分离与6个蛋白质梯度分离的比较。

图4大肠杆菌裂解物数据（顶部）与蛋白质标记梯度n=6的镜像重叠图

对6次运行结果（表3和表4）进一步分析确定，峰迁移时间变化<0.1%RSD，峰面积变化<3%RSD。

表3 选定大肠杆菌裂解物峰迁移次数n=6的重现性

表4选定大肠杆菌裂解物峰高次数n=6的重现性

结论

我们成功地利用悟空HPCE Peregrine系统测定了大肠杆菌裂解液中具有丰富含量的蛋白质的分子量（14.4、32.6和56.1kDa）。HPCE Peregrine在分子水平上显示了可靠、高质量的可重复性数据，因其重量测定（<1%RSD）和定量测定（<3%RSD）使其成为细胞裂解物分析的理想工具。