应用说明：转铁蛋白

用悟空HPCE-512毛细管电泳仪Peregrine I免标记内成像技术分析转铁蛋白

摘要

利用高效毛细管电泳Peregrine I系统和悟空HPCE专有的LFII^®技术，成功地分析和解析了转铁蛋白亚型，包括碳水化合物还原转铁蛋白（CDT）。这证明了它在峰迁移率（<0.5%RSD）和峰面积（~2%RSD）方面产生高质量可重复数据的能力。以前的电泳分析方法非常复杂，存在重复性差的问题。转铁蛋白是一种参与铁离子转运的血浆糖蛋白，是慢性酒精中毒的常规标志物之一。

简介

转铁蛋白（Tf）是血浆中主要的铁转运蛋白。它是一种糖蛋白，在氨基酸、铁和碳水化合物含量方面表现出微不均一性。Tf具有两条天冬酰胺连接的N-聚糖链，由中性糖组成，形成双、三和四触角结构，末端带有带负电荷的唾液酸残基。唾液酸含量变化，产生最多8种唾液酸残基的亚型。这些亚型的分子量在75~79kDa之间，等电点在5.2~5.9之间。正态分布的特点是唾液形态的分布，前显性形式是四唾液转铁蛋白，二、三、五和六唾液酸的含量明显较低。

血清唾液酸含量的变化与不同的病理状态有关。低唾液酸形式（即二唾液转铁蛋白和亚唾液转铁蛋白）的相对水平的增加与酒精滥用有关。缺糖转铁蛋白（CDT）是这类唾液酸化较少的转铁蛋白亚型的统称。

本报告展示了HPCE Peregrine I使用毛细管区带电泳（CZE）对Tf唾液酸型进行无标记分析的能力。由于蛋白质粘附在毛细管内表面上，用CZE分离天然蛋白质存在问题。这可能导致电流不稳定，分离效率低，重现性差，有时缺乏分析物洗脱。利用Katayama等人1998年开发的连续多离子层（SMIL）涂层减少了蛋白质吸收，并根据净电荷的差异分离转铁蛋白亚型。

材料和方法

转铁蛋白在内径为50μm，分离长度为62cm的裸石英毛细管中进行分析。SMIL毛细管涂层是使用Katayama等人详述的方案生成的。但毛细管是用专利方法清洗的。电泳在硼酸盐缓冲液中进行，使用专利添加剂。缓冲液通过0.2μm过滤器，在使用前脱气。样品在5kV电压下注射25s，在16kV电压下电泳。样品在流动缓冲液中用5%三氯化铁溶液稀释至1mg/mL。分析前，样品在室温下孵育10min，以留出时间使铁饱和。

用霍乱弧菌（BioChemika）中的神经氨酸酶消化样品。每1mg/mL Tf样品用1U/mL酶溶液在专用缓冲液中处理。样品在37℃下孵育5h。每60min取出一小份，以评估反应的进展。通过将pH值提高到8停止消化，并将样品储存于4°C。在运行之间，使用专有方法冲洗毛细管，然后进行自动欧姆定律绘图。

结果和讨论

利用悟空HPCE等相位梯度算法（EVA）和广义分离变换（GST）算法对转铁蛋白糖链进行快速分析和高效分离。GST是一种将512像素的数据以自然的方式组合起来的方法，它保留了像素的峰值形状信息，同时使信噪比最大化。通常，与单一电泳图相比，使用GST的信噪比增加了10倍。此外，吸光度A可以直接从GST图的峰值高度V中读出，作为时间t的函数（A＝0.434×V（t））。

EVA是一种先进的模式识别工具，它使系统分辨率最大化，并将定量信息转换成峰高度而不是面积。在EVA中，首先分析电泳图以找到局部峰。这些首先用于执行顶点（确定频带的原点），然后产生信号输出。用硫脲测试了SMIL涂层产生的电渗流的强度和稳定性，其峰迁移时间、峰面积和峰高分别为0.7%、2.1%和2.1%。全息转铁蛋白样品的GST和EVA处理数据如图1所示，tetra-sialo-Tf RSD见表1，penta-sialo-Tf的RSD见表2。

涂层的稳定性和重现性及HPCE仪器允许对转铁蛋白的酶基脱乙酰化进行时间顺序监测。

神经氨酸酶处理的转铁蛋白样品结果显示EVA包含在每小时的小份之间，以显示消化的进展。反应的发展可以通过脱乙酰亚型的出现和高唾液酸型峰面积的减少来监测。

图2人全转铁蛋白用神经氨酸酶治疗1h（蓝色）和2h（红色）后的EVA处理叠加数据。峰识别：P1-单唾液酸Tf，P2-双唾液酸Tf，P3-三唾液酸Tf，P4-四唾液酸Tf和P5-五唾液酸Tf

在一小时内（图2），主要的唾液酸形式四唾液酸转铁蛋白和五唾液酸转铁蛋白随着三和二唾液酸转铁蛋白的增加和单唾液酸亚型的出现而显著减少。随着反应的进行，所有较高的唾液酸形式都逐渐减少（图3-4）。

图3人全转铁蛋白用神经氨酸酶治疗2h（蓝色）和3h（红色）后的EVA处理叠加数据。峰鉴定：P0-阿西亚洛Tf，P1-单唾液酸Tf，P2-二唾液酸Tf，P3-三唾液酸Tf，P4-四唾液酸Tf。

图4人全转铁蛋白用神经氨酸酶治疗3h（蓝色）和4h（红色）后的EVA处理叠加数据。峰鉴定：P0-阿西亚洛Tf，P1-单唾液酸Tf，P2-二唾液酸Tf，P3-三唾液酸Tf，P4-四唾液酸Tf。

5h后（图5）出现的主要峰值是亚洲酸化和单唾液酸化转铁蛋白亚型。EVA数据叠加显示了峰值从1h等分到5h等分的变化（图6）。

图5 人全转铁蛋白用神经氨酸酶治疗4h（蓝色）和5h（红色）后的EVA处理叠加数据。峰鉴定：P0-阿西亚洛Tf，P1-单唾液酸Tf，P2-二唾液酸Tf，P3-三唾液酸Tf。

图6 人全转铁蛋白用神经氨酸酶治疗1h（蓝色）和5h（红色）后的EVA处理叠加数据。峰鉴定：P0-阿西亚洛Tf，P1-单唾液酸Tf，P2-二唾液酸Tf，P3-三唾液酸Tf，P4-四唾液酸Tf，P5-五唾液酸Tf

结论

有几种电泳方法已被证实对转铁蛋白异构体的分离是有效的，但是大多数方法很难建立并且不能提供可重复的结果。

借助SMIL涂层，在悟空HPCE Peregrine I平台上对转铁蛋白亚型的分析为分析CDT亚型提供了一种全新的、可靠的工具。

 悟空HPCE Peregrine I平台在转铁蛋白分析中的优点是操作简单、分离速度快和唾液酸形态之间的分辨率高。涂层的稳定性和结果的重现性证明了该技术的稳健性。

转铁蛋白-蛋白质，CZE

使用SMIL涂层的悟空 HPCE平台对转铁蛋白的分析

使用Peregrine I高效毛细管电泳系统和悟空HPCE专有的LFII^®技术成功地分析和解析了转铁蛋白亚型（包括CDT），峰迁移率（<0.5%RSD）和峰面积（~2%RSD）证明了其数据具有良好的重现性。

以往的电泳分析方法大多非常复杂，存在重复性不好的问题。

转铁蛋白是一种参与铁离子转运的血浆糖蛋白。糖缺乏转铁蛋白（CDT）是慢性酒精中毒的常规标志物之一。