一、 摘要

本文使用悟空K2025高效液相色谱仪测定氟苯尼考粉中氟苯尼考的含量。色谱条件：色谱柱为C₁₈ 色谱柱（4.6×250mm，5μm），流速为1.0mL/min，柱温为25℃，进样量为10μL，检测波长为224nm。实验结果：甲砜霉素峰与氟苯尼考峰的分离度为18.85；氟苯尼考峰的理论塔板数为16754；重复性测试中，将氟苯尼考标准溶液连续进样7针，保留时间的RSD为0.000%，峰面积的RSD为0.119%；灵敏度测试中，氟苯尼考的仪器检出限为0.029μg/mL，仪器定量限为0.096μg/mL；氟苯尼考在测定浓度范围内具有良好的线性关系，确定系数R²为0.9999；对氟苯尼考粉进行含量测定，其氟苯尼考的含量为22.9%，加标回收率为96.4%。因此，Wooking K2025高效液相色谱仪满足《中国兽药典（2020年版）》中氟苯尼考粉中氟苯尼考含量测定的需求。

二、 背景

氟苯尼考粉为白色或类白色粉末，属于酰胺醇类抗生素，为《中国兽药典（2020年版）》一部中收录的品种，用于巴氏杆菌和大肠埃希菌感染。

三、 实验过程

1 范围

适用于氟苯尼考粉中氟苯尼考的含量测定。

2 原理

使用乙腈-水-冰醋酸混合溶液（100:197:3）提取氟苯尼考粉中的氟苯尼考；氟苯尼考在224nm处有紫外吸收，在等度洗脱条件下，采用高效液相色谱法测定，外标法定量。

3 试剂与材料

3.1 水：符合GB/T6682的一级水；

3.2 乙腈：色谱纯；

3.3 冰醋酸：优级纯；

3.4 流动相：乙腈-水-冰醋酸=100:197:3；

3.5 氟苯尼考对照品：纯度为99.5%；

3.6 甲砜霉素对照品：纯度为99.0%；

3.7 0.22μm微孔有机滤膜。

4 仪器与设备

4.1 高效液相色谱仪：K2025 P2二元高压输液泵、K2025 AS自动进样器、K2025 CO柱温箱、K2025 UVD紫外-可见光检测器、Wookinglab色谱工作站；

4.2 分析天平：精确到0.0001g；

4.3 涡旋振荡器；

4.4 容量瓶：10mL、25mL，棕色带刻度。

5 测定步骤

5.1溶液配制

5.1.1 氟苯尼考标准储备液的配制：精密称取氟苯尼考对照品（3.5）约10mg，置于10mL棕色容量瓶中，用流动相（3.4）溶解并定容至刻度，摇匀，即得氟苯尼考浓度为885.550μg/mL的标准储备液；

5.1.2 甲砜霉素标准储备液的配制：精密称取甲砜霉素对照品（3.6）约10mg，置于10mL棕色容量瓶中，用流动相（3.4）溶解并定容至刻度，摇匀，即得甲砜霉素浓度为1128.600μg/mL的标准储备液；

5.1.3 系统适用性溶液：准确吸取氟苯尼考标准储备液（5.1.1）和甲砜霉素标准储备液（5.1.2）各适量，用流动相（3.4）稀释，制得氟苯尼考和甲砜霉素浓度分别为50μg/mL和30μg/mL的系统适用性溶液；

5.1.4 氟苯尼考标准工作液的配制：吸取氟苯尼考标准储备液（5.1.1）适量，用流动相（3.4）稀释，制得氟苯尼考浓度依次为5.535μg/mL、11.069μg/mL、22.139μg/mL、44.278μg/mL、88.555μg/mL和177.110μg/mL的系列标准工作液。

5.2 样品前处理

取氟苯尼考粉适量（约相当于氟苯尼考25mg），精密称定，置于25mL容量瓶中，用流动相（3.4）溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过；精密量取续滤液适量，用流动相（3.4）稀释至适当浓度，供高效液相色谱仪测定。

5.3色谱条件

a）色谱柱：C₁₈色谱柱，4.6×250mm，5μm或者相当的色谱柱；

b）流动相：详见3.4；

c）流速：1.0mL/min；

d）柱温：25℃；

e）检测器：紫外检测器，检测波长：224nm；

f） 进样量：10μL。

6 结果

6.1 重复性测试

按照色谱条件（5.3）进行采集，系统适用性溶液的色谱图如图1所示，积分结果如表1所示。

图1系统适用性溶液的色谱图

表1 系统适用性溶液色谱图积分结果

由表1中数据可知，甲砜霉素峰与氟苯尼考峰的分离度为18.85，满足《中国兽药典（2020年版）》中规定的甲砜霉素峰与氟苯尼考峰的分离度应大于4.0的要求；氟苯尼考峰的理论塔板数为16754，满足《中国兽药典（2020年版）》中规定的理论塔板数按氟苯尼考峰计算应不低于2500的要求。

将氟苯尼考标准溶液（浓度为44.278μg/mL）连续进样7针，叠加的色谱图如图2所示，结果见表2。