一、 摘要

本文使用悟空K2025高效液相色谱仪测定面粉中嘌呤的含量。本实验采用反相色谱法，使用等度洗脱，色谱条件：C18色谱柱（4.6×250mm，5μm），流速为1.0mL/min，柱温为30℃，进样量为10μL，检测器为紫外-可见光检测器，检测波长为254nm。实验结果：鸟嘌呤、次黄嘌呤、腺嘌呤和黄嘌呤的理论塔板数范围为12471~17151，拖尾因子范围为1.13~1.25；四种嘌呤混合标准溶液连续进样7针进行重复性测试，保留时间的RSD范围为0.113%~0.194%，峰面积的RSD范围为0.378%~0.464%；灵敏度测试中，四种嘌呤的仪器检出限范围为0.011μg/mL~0.023μg/mL，仪器定量限范围为0.037μg/mL~0.078μg/mL；四种嘌呤在测定浓度范围内均呈现良好的线性关系，确定系数R2在0.999以上；对试样进行测定，市售面粉中嘌呤的含量为150mg/kg，其中鸟嘌呤的含量为73.9mg/kg，次黄嘌呤的含量为69.3mg/kg，腺嘌呤的含量为3.11mg/kg，黄嘌呤的含量为3.37mg/kg；加标回收实验中，四种嘌呤的加标回收率范围为94.8%~108.3%。

二、 背景

嘌呤为无色结晶的有机物，是身体内存在的一类物质，主要以嘌呤核苷酸的形式存在，在作为能量供应、代谢调节及组成辅酶等方面起着十分重要的作用。嘌呤在人体内氧化变成尿酸，人体尿酸过高就会引起痛风。海鲜、动物的肉中嘌呤含量都比较高，有痛风的病人除用药物治疗外（医治痛风的药物一般对肾都有损害），更重要的是平时注意忌口，因此测定食品中嘌呤的含量对有痛风疾病人群来说具有重要意义。

三、 实验过程

1 范围

适用于面粉中鸟嘌呤、次黄嘌呤、腺嘌呤和黄嘌呤的含量测定。

2 原理

面粉试样中的嘌呤化合物在高温条件下经三氟乙酸和甲酸溶液水解形成游离态嘌呤，水解液浓缩并用磷酸二氢钾溶液复溶后，以甲醇和磷酸二氢钾溶液为流动相，使用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱和二元高压泵系统，采用等度洗脱，用紫外-可见光检测器检测，外标法定量。

3 试剂与材料

3.1 水：符合GB/T 6682的一级水；

3.2 甲醇：色谱纯；

3.3 氢氧化钠：分析纯；

3.4 三氟乙酸：色谱纯；

3.5 甲酸：色谱纯；

3.6 磷酸：色谱纯；

3.7 磷酸二氢钾：分析纯；

3.8 氢氧化钠溶液（10mmol/L）：称取0.04g氢氧化钠（3.3），加水（3.1）溶解，放冷后定容至100mL，混匀；

3.9 试样提取液：量取45mL三氟乙酸（3.4），45mL甲酸（3.5），加水（3.1）定容至100mL，混匀；

3.10 10%磷酸溶液：取10mL磷酸（3.6），加水（3.1）稀释并定容至100mL，混匀；

3.11 7mmol/L磷酸二氢钾溶液（pH=3.8）：称取磷酸二氢钾（3.7）0.957g（精确到0.001g），加900mL水（3.1）溶解并用水（3.1）定容至1L，混匀，用10%磷酸溶液（3.10）调节pH至3.8；

3.12 10%甲醇水溶液：取10mL甲醇（3.2）和90mL水（3.1），混匀；

3.13 鸟嘌呤标准品：CAS号为73-40-5，纯度为99.9%；

3.14 次黄嘌呤标准品：CAS号为68-94-0，纯度为99.5%；

3.15 腺嘌呤标准品：CAS号为73-24-5，纯度为99.9%；

3.16 黄嘌呤标准品：CAS号为69-89-6，纯度为99.9%；

3.17 市售面粉。

4 仪器与设备

4.1 高效液相色谱仪：K2025 P2二元高压输液泵、K2025 AS自动进样器、K2025 CO柱温箱、K2025 UVD紫外-可见光检测器、Wookinglab色谱工作站；

4.2 分析天平：精确到0.0001g；

4.3 涡旋振荡器；

4.4 恒温水浴装置；

4.5 超声波清洗机；

4.6 pH计；

4.7 旋转蒸发仪；

4.8 具塞锥形瓶：50mL；

4.9 玻璃漏斗；

4.10 定量滤纸；

4.11 梨形烧瓶：50mL；

4.12 容量瓶：10mL、50mL、100mL、1000mL，棕色带刻度；

4.13 精密移液器：100μL、1000μL、10mL；

4.14 0.45μm微孔水相滤膜。

5 测定步骤

5.1 标准溶液的配制

5.1.1 嘌呤混合标准储备液的配制

分别准确称取鸟嘌呤（3.13）、次黄嘌呤（3.14）、腺嘌呤（3.15）和黄嘌呤（3.16）各约10mg（精确至0.01mg）于100mL容量瓶中，加10mmol/L氢氧化钠溶液（3.8）溶解并定容至刻度，混匀，制得鸟嘌呤浓度为104.90μg/mL、次黄嘌呤浓度为97.01μg/mL、腺嘌呤浓度为99.90μg/mL和黄嘌呤浓度为99.90μg/mL的嘌呤混合标准储备液，4℃可保存6个月。

5.1.2 嘌呤混合标准系列工作液的配制

量取上述混合标准储备液（5.1.1），用磷酸二氢钾溶液（3.11）稀释，制得鸟嘌呤浓度依次为0.10μg/mL、0.21μg/mL、0.52μg/mL、1.05μg/mL、5.24μg/mL和10.49μg/mL，次黄嘌呤浓度依次为0.10μg/mL、0.19μg/mL、0.49μg/mL、0.97μg/mL、4.85μg/mL和9.70μg/mL，腺嘌呤浓度依次为0.10μg/mL、0.20μg/mL、0.50μg/mL、1.00μg/mL、5.00μg/mL和9.99μg/mL，黄嘌呤浓度依次为0.10μg/mL、0.20μg/mL、0.50μg/mL、1.00μg/mL、5.00μg/mL和9.99μg/mL的嘌呤混合标准系列工作液，现用现配。

5.2 试样测试液的制备

试样做2次平行实验。称取面粉试样（3.17）4.0g（精确至0.1g）于具塞锥形瓶（4.8）中，加入10mL试样提取液（3.9），涡旋混匀，于80℃水浴水解60min，取出后冷却至室温，转移至50mL容量瓶中，用试样提取液（3.9）定容至刻度，混匀后用定量滤纸（4.10）过滤。吸取2mL滤液，使用旋转蒸发仪（4.7）旋转蒸发至近干，用2mL磷酸二氢钾溶液（3.11）溶解，过0.45μm水相滤膜，用样品瓶收集，即为试样测试液1和试样测试液2。

同时做空白试验，步骤同试样测试液。

5.3 加标回收实验

称取面粉试样（3.17）4.0g（精确至0.1g）于具塞锥形瓶（4.8）中，加入10mL试样提取液（3.9）、250μL嘌呤混合标准储备液（5.1.1），涡旋混匀，后续步骤同5.2，即为试样加标测试液。

5.4 色谱条件

a）色谱柱：C18色谱柱，4.6×250mm，5μm或者相当的色谱柱；

b）流动相：甲醇（3.2）:磷酸二氢钾溶液（3.11）=1:99；

c）流速：1.0mL/min；

d）进样量：10μL；

e）洗针液：10%甲醇水溶液（3.12）；

f）柱温：30℃；

g）检测器及检测波长：检测器为紫外-可见光检测器，检测波长为254nm。

6 实验结果

6.1 重复性测试

待仪器工作状态稳定后，按照上述色谱条件（5.4）进行采集，四种嘌呤混合标准溶液（鸟嘌呤浓度为0.52μg/mL，次黄嘌呤浓度为0.49μg/mL，腺嘌呤浓度为0.50μg/mL，黄嘌呤浓度为0.50μg/mL）的色谱图如图1所示，积分结果如表1所示。

 

图1 四种嘌呤混合标准溶液的色谱图

表1 四种嘌呤混合标准溶液色谱图积分结果

由表1中数据可知，鸟嘌呤峰的理论塔板数为14341，拖尾因子为1.23；次黄嘌呤峰的理论塔板数为12471，拖尾因子为1.25；腺嘌呤峰的理论塔板数为15722，拖尾因子为1.16；黄嘌呤峰的理论塔板数为17151，拖尾因子为1.13，均具有较好的峰形。

将四种嘌呤混合标准溶液（鸟嘌呤浓度为0.52μg/mL，次黄嘌呤浓度为0.49μg/mL，腺嘌呤浓度为0.50μg/mL，黄嘌呤浓度为0.50μg/mL）连续进样7针，叠加的色谱图如图2所示，积分结果如表2所示。

 

图2 四种嘌呤混合标准溶液连续进样7针叠加的色谱图

表2 四种嘌呤混合标准溶液连续进样7针重复性数据统计

由表2中数据可知，四种嘌呤混合标准溶液（鸟嘌呤浓度为0.52μg/mL，次黄嘌呤浓度为0.49μg/mL，腺嘌呤浓度为0.50μg/mL，黄嘌呤浓度为0.50μg/mL）连续进样7针进行重复性测试，鸟嘌呤峰保留时间的RSD为0.132%，峰面积的RSD为0.457%；次黄嘌呤峰保留时间的RSD为0.194%，峰面积的RSD为0.464%；腺嘌呤峰保留时间的RSD为0.113%，峰面积的RSD为0.433%；黄嘌呤峰保留时间的RSD为0.116%，峰面积的RSD为0.378%，均具有良好的定性定量重复性。

6.2 仪器灵敏度测试

灵敏度测试的谱图如图3所示，计算结果如表3所示。

 

图3 仪器灵敏度的色谱图

表3 仪器灵敏度测试数据

由表3中数据可知，鸟嘌呤的仪器检出限为0.012μg/mL，仪器定量限为0.040μg/mL；次黄嘌呤的仪器检出限为0.011μg/mL，仪器定量限为0.037μg/mL；腺嘌呤的仪器检出限为0.012μg/mL，仪器定量限为0.040μg/mL；黄嘌呤的仪器检出限为0.023μg/mL，仪器定量限为0.078μg/mL。

6.3 含量测定

6.3.1校准曲线的测定

按照上述色谱条件（5.4）进行采集，将四种嘌呤混合标准系列工作液（5.1.2）上机测定，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制校准曲线，线性方程和确定系数如图4~图7所示。

图5 次黄嘌呤的校准曲线

图7 黄嘌呤的校准曲线

由图4~图7中数据可知，四种嘌呤在测定浓度范围内均呈现良好的线性关系，确定系数R2在0.999以上。四种嘌呤混合标准系列工作液叠加的色谱图如图8所示。

 

图8 四种嘌呤混合标准系列工作液叠加色谱图

6.3.2含量计算

按照步骤5.2对市售面粉进行处理。依据公式（1）计算市售面粉中各嘌呤的含量，依据公式（2）计算市售面粉中四种嘌呤的总含量。

试样中嘌呤含量为鸟嘌呤、次黄嘌呤、腺嘌呤和黄嘌呤含量的总和。

空白溶液、面粉试样的测试液和试样加标测试液的色谱图如图9～图12所示。

 

图9空白溶液的色谱图

 

图10试样测试液1的色谱图

 

图11试样测试液2的色谱图

 

图12试样加标测试液的色谱图

依据公式（1）和公式（2）计算面粉试样中嘌呤的含量，测得其嘌呤的含量为150mg/kg，其中鸟嘌呤的含量为73.9mg/kg，次黄嘌呤的含量为69.3mg/kg，腺嘌呤的含量为3.11mg/kg，黄嘌呤的含量为3.37mg/kg；加标回收实验中，鸟嘌呤的加标回收率为107.2%，次黄嘌呤的加标回收率为108.3%，腺嘌呤的加标回收率为95.8%，黄嘌呤的加标回收率为94.8%。

7 结论

本实验采用反相色谱法，使用等度洗脱，通过对四种嘌呤的理论塔板数、重复性、灵敏度、线性的测试以及对面粉试样中嘌呤的含量进行测定，实验结果表明：鸟嘌呤、次黄嘌呤、腺嘌呤和黄嘌呤的理论塔板数范围为12471~17151，拖尾因子范围为1.13~1.25，均具有较好的峰形；四种嘌呤混合标准溶液连续进样7针进行重复性测试，保留时间的RSD范围为0.113%~0.194%，峰面积的RSD范围为0.378%~0.464%，均具有良好的定性定量重复性；灵敏度测试中，四种嘌呤的仪器检出限范围为0.011μg/mL~0.023μg/mL，仪器定量限范围为0.037μg/mL~0.078μg/mL；四种嘌呤在测定浓度范围内均呈现良好的线性关系，确定系数R2在0.999以上；对试样进行测定，市售面粉中嘌呤的含量为150mg/kg，其中鸟嘌呤的含量为73.9mg/kg，次黄嘌呤的含量为69.3mg/kg，腺嘌呤的含量为3.11mg/kg，黄嘌呤的含量为3.37mg/kg；加标回收实验中，四种嘌呤的加标回收率范围为94.8%~108.3%。因此，Wooking K2025 HPLC满足《NY/T 4355-2023农业行业标准 农产品及其制品中嘌呤的测定》中嘌呤含量测定的需求。

附1：仪器配置清单

附2：悟空Wooking  K2025高效液相色谱仪（可靠、精准、友好、合规）

 

报告人：王禹茼     

联系方式：13120170855