一、 背景

附桂骨痛片为中成药，由附子（制）、制川乌、肉桂、党参、当归、炒白芍、淫羊藿、醋乳香组成；具有温阳散寒，盖气活血，消肿止痛的功效。附子与川乌均来自毛莨科乌头属,乌头属植物主要的药用成分为二萜类生物碱，具有镇痛、局麻、抗炎等药理活性，但该类成分具有一定毒性，主要表现为心肌毒性、神经毒性等，严重时可引起死亡，因此需要对附桂骨痛片中的乌头双酯型生物碱（新乌头碱、次乌头碱、乌头碱）进行限量检查。

二、 原理

将附桂骨痛片除去糖衣后研细，经乙腈-浓氨试液混合溶液超声提取，滤液减压回收至干，净化富集，采用梯度洗脱条件，用紫外-可见光检测器检测，通过保留时间定性。

三、 试剂与材料

3.1 水：符合GB/T 6682的一级水；

3.2 甲醇：色谱纯；

3.3 乙腈：色谱纯；

3.4 四氢呋喃：色谱纯；

3.5 浓氨水：含NH₃应为25 %~28 %（g/g），分析纯；

3.6 盐酸：分析纯；

3.7 磷酸：色谱纯；

3.8 磷酸二氢钾：色谱纯；

3.9 乙腈-浓氨试液：分别移取90 mL乙腈（3.3）和10 mL浓氨水（3.5），混匀，备用；

3.10 0.1 mol/L盐酸溶液：取盐酸（3.6）0.84 mL，加水（3.1）稀释至100 mL，混匀，备用；

3.11 0.1 %磷酸溶液：取磷酸（3.7）0.1 mL，加水（3.1）稀释至100 mL，混匀，备用；

3.12 乙腈-0.1 %磷酸溶液混合溶液：分别移取30 mL乙腈（3.3）和70 mL 0.1 %磷酸溶液（3.11），混匀，备用；

3.13 流动相A：分别移取250 mL乙腈（3.3）和150 mL四氢呋喃（3.4），混匀，超声10 min后备用；

3.14 流动相B：称取4.08 g磷酸二氢钾（3.8），加1 L水（3.1）使之溶解；再加入磷酸（3.7）1 mL，混匀，超声10 min后备用；

3.15 乌头双酯型生物碱对照提取物：已标示新乌头碱、次乌头碱和乌头碱的含量；

3.16 附桂骨痛片：市售，实验前除去糖衣。

四、 仪器与设备

4.1高效液相色谱仪：K2025 P2二元高压输液泵、K2025 AS自动进样器、K2025 CO柱温箱、K2025 UVD紫外-可见光检测器、Wookinglab色谱工作站；

4.2分析天平：精确到0.0001 g；

4.3涡旋振荡器；

4.4超声波清洗机；

4.5移液器：200 μL、1000 μL；

4.6容量瓶：10 mL、50 mL、1000 mL，棕色带刻度；

4.7具塞锥形瓶；

4.8 减压回收装置；

4.9 固相萃取柱：以混合型阳离子交换反相吸附剂为填充剂，150 mg，容量为6 mL；

4.10 离心管：15 mL、50 mL；

4.11一次性针头注射器；

4.12 0.22 μm有机针式过滤器。

五、 测定步骤

5.1 对照提取物溶液和灵敏度溶液的配制

5.1.1取乌头双酯型生物碱对照提取物（3.15）适量，精密称定，加乙腈（3.3）制成每1 mL含新乌头碱、次乌头碱和乌头碱各0.2 mg的溶液，即得对照提取物储备液。

5.1.2精密量取上述对照提取物储备液（5.1.1）5 mL，置于50 mL容量瓶中，加0.1 %磷酸溶液（3.11）稀释至刻度，摇匀，制成每1 mL含新乌头碱、次乌头碱和乌头碱各20 μg的溶液，即得对照提取物溶液。

5.1.3将对照提取物溶液（5.1.2）用0.1 %磷酸溶液（3.11）稀释100倍，制成每1 mL含新乌头碱、次乌头碱和乌头碱各0.2 μg的溶液，即得灵敏度溶液。

5.2 供试品溶液和供试品加标溶液的制备

5.2.1取附桂骨痛片10片，除去糖衣，研细，精密称定，称取1.32 g，置于具塞锥形瓶（4.7）中，加乙腈-浓氨试液混合溶液（3.9）25 mL超声处理30分钟，滤过，滤液于40 ℃以下减压回收溶剂至干，残渣加0.1 mol盐酸溶液（3.10）10 mL使溶解，滤过，滤液加在预先依次用乙腈（3.3）、水（3.1）各6 mL洗脱的固相萃取柱（4.9）上，依次以0.1 mol盐酸溶液（3.10）、甲醇（3.2）、乙腈（3.3）各5 mL洗脱，待洗脱液流尽后，放置5分钟，用乙腈-浓氨试液混合溶液（3.9）10 mL洗脱，收集洗脱液，于 40 ℃以下减压回收溶剂至干，残渣精密加入乙腈-0.1 %磷酸溶液混合溶液（3.12）3 mL使溶解，滤过，取续滤液，即得供试品溶液，待上机测定。

5.2.2取附桂骨痛片10片，除去糖衣，研细，精密称定，称取1.32 g，置于具塞锥形瓶（4.7）中，加乙腈-浓氨试液混合溶液（3.9）25 mL，再加入150 μL对照提取物储备液（5.1.1），后续步骤同供试品溶液的制备过程（5.2.1），即得供试品加标溶液，待上机测定。

5.3 色谱条件

a）色谱柱：C₁₈，4.6×250 mm，5 μm或者相当的色谱柱；

b）流动相：以乙腈-四氢呋喃混合溶液（3.13）为流动相A，磷酸二氢钾溶液（3.14）为流动相B；按下表进行梯度洗脱：

注：按照此梯度洗脱表运行存在系统压力无法平衡，基线不稳的情况，故设置每次进样前平衡10min。

c）流速：1.0 mL/min；

d）进样量：10 μL；

e）洗针液：90 %甲醇水溶液；

f）柱温：25 ℃；

g）检测器及检测波长：检测器为紫外-可见光检测器，检测波长为232 nm。

六、 测定结果

6.1 对照提取物溶液的测定

按照上述色谱条件（5.3）进行采集，对照提取物溶液（5.1.2）的色谱图如图1所示，积分结果如表1所示。

 

图1 对照提取物溶液的色谱图

表1 对照提取物溶液色谱图积分结果

由表1中数据可知，乌头碱峰的理论塔板数为70282，满足《中国药典（2025年版）》中规定的理论塔板数按乌头碱峰计算应不低于60000的要求；3种化合物的分离度≥5.16，均可以达到基线分离；拖尾因子均为1.11，均具有良好的峰形。

将对照提取物溶液（5.1.2）连续进样7针进行重复性测试，叠加的色谱图如图2所示，结果见表2。

 

图2对照提取物溶液连续进样7针叠加的色谱图

表2对照提取物溶液连续进样7针重复性数据统计

由表2中数据可知，对照提取物溶液连续进样7针进行重复性测试，其中新乌头碱保留时间的RSD为0.12 %，峰面积的RSD为0.18 %；次乌头碱保留时间的RSD为0.11 %，峰面积的RSD为0.24 %；乌头碱保留时间的RSD为0.12 %，峰面积的RSD为0.28 %，均具有良好的定性定量重复性。

6.2 仪器灵敏度的测定

按照上述色谱条件（5.3）进行采集，灵敏度溶液（3种化合物的浓度均为0.2 µg/mL）的色谱图如图3所示，计算结果见表3。

 

图3仪器灵敏度的色谱图

表3仪器灵敏度测试数据

由表3中数据可知，3种化合物的仪器检出限范围为0.080 μg/mL~0.167 μg/mL，仪器定量限范围为0.247 μg/mL~0.556 μg/mL。

6.3 检查

按照色谱条件（5.3），对空白溶液和供试品溶液进行采集，色谱图如图4~图5所示，积分结果见表4。

 

图4 空白溶液的色谱图

 

图5 供试品溶液的色谱图

表4 供试品溶液色谱图积分结果表

从表4中数据可知，附桂骨痛片供试品溶液中新乌头碱、乌头碱的峰面积之和为11.171mAU.s，满足《中国药典（2025年版）》中，与对照提取物3个色谱峰保留时间相对应的色谱峰的峰面积之和不得大于对照提取物色谱图中乌头碱色谱峰的峰面积（240.884mAU.s）的要求。

按照色谱条件（5.3），对供试品加标溶液（5.2.2）进行采集，供试品溶液和供试品加标溶液的叠加色谱图如图6所示，采用单点定量法对供试品加标溶液的回收率进行计算，计算结果如表5所示。

 

图6 供试品溶液和供试品加标溶液的叠加色谱图

表5供试品加标溶液加标回收率结果表

由表5中数据可知，加标回收实验中，3种化合物的加标回收率范围均≥83.0 %。 

七、 结论

本文使用悟空K2025高效液相色谱仪进行附桂骨痛片中乌头双酯型生物碱的检查。本实验以乙腈-四氢呋喃混合溶液和磷酸二氢钾溶液作为流动相，采用梯度洗脱条件，实验结果表明：乌头碱峰的理论塔板数为70282，满足《中国药典（2025年版）》中规定的理论塔板数按乌头碱峰计算应不低于60000的要求；3种化合物的分离度≥5.16，均可以达到基线分离；拖尾因子均为1.11，均具有良好的峰形；对照提取物溶液连续进样7针进行重复性测试，其中3种化合物保留时间的RSD范围为0.11 %~0.12 %，峰面积的RSD范围为0.18 %~0.28 %，均具有良好的定性定量重复性；附桂骨痛片供试品溶液中新乌头碱、乌头碱的峰面积之和为11.171 mAU.s，满足《中国药典（2025年版）》中，与对照提取物3个色谱峰保留时间相对应的色谱峰的峰面积之和不得大于对照提取物色谱中乌头碱色谱峰的峰面积（240.884 mAU.s）的要求；加标回收实验中，3种化合物的加标回收率均≥83.0 %。因此，使用悟空K2025高效液相色谱仪进行附桂骨痛片中乌头双酯型生物碱的检查，完全满足《中国药典（2025年版）》中的要求。

附1：仪器配置清单