一、 背景

藿香正气水作为经典中成药制剂，由藿香、甘草、白术等多味中药组方而成，具有解表化湿、理气和中的功效，广泛用于治疗外感风寒、内伤湿滞或夏伤暑湿所致的胃肠型感冒、呕吐泄泻等症。其中，甘草浸膏作为方剂中的关键辅料及活性成分载体，富含甘草酸、甘草苷等三萜皂苷类成分，不仅发挥调和诸药、缓急止痛的作用，还兼具抗炎、抗氧化、调节免疫等药理活性，对制剂整体疗效及安全性具有重要影响。

然而，甘草浸膏的质量受原料来源、提取工艺及复方配伍复杂性等因素制约，其活性成分含量易出现波动，直接影响藿香正气水的批次间一致性与临床效果稳定性。藿香正气水中甘草浸膏特征性成分（如甘草酸）的精准测定，对提升该制剂的质量可控性、保障临床疗效均一性、推动中药复方标准化及现代化生产具有重要意义。

藿香正气水为《中国药典（2025年版）》收录的中成药品种，与2020年版相比，《中国药典（2025年版）》中新增了甘草浸膏的含量测定。

二、 原理

藿香正气水试样经甲醇超声波辅助提取后，采用反相色谱等度洗脱条件，使用紫外-可见光检测器检测，以保留时间定性，外标法定量。

三、 实验过程

1 试剂与材料

1.1 水：符合GB/T 6682的一级水；

1.2 甲醇：色谱纯；

1.3 乙腈：色谱纯；

1.4 乙醇：色谱纯；

1.5 磷酸：色谱纯；

1.6 0.1 %磷酸水溶液：准确量取1 mL磷酸（1.5）至1000 mL容量瓶，加水（1.1）溶解并定容至刻度，混匀；

1.7 50 %乙醇溶液：分别量取50 mL乙醇（1.4）和50 mL水（1.1），混匀；

1.8 甘草酸铵标准品：CAS号为53956-04-0，纯度为99.5%；

1.9 藿香正气水试样，市售。

2 仪器与设备

2.1 高效液相色谱仪：K2025 P2二元高压输液泵、K2025 AS自动进样器、K2025 CO柱温箱、K2025 UVD紫外-可见光检测器、Wookinglab色谱工作站；

2.2 分析天平：精确到0.0001 g；

2.3 涡旋混合器；

2.4 超声波清洗机；

2.5 量筒：10 mL、100 mL；

2.6 移液器：100 μL、1000 μL；

2.7 容量瓶：10 mL、1000 mL，棕色带刻度；

2.8 具塞锥形瓶：50 mL；

2.9一次性针头注射器；

2.10 微孔滤膜：0.22 μm，有机相。

3 测定步骤

3.1 标准储备液的配制

准确称取甘草酸铵标准品（1.8）10 mg，置于10 mL容量瓶中，用50 %乙醇溶液（1.7）溶解并定容至刻度，混匀，此时甘草酸铵标准储备液的浓度为1.0 mg/mL，即得甘草酸浓度为0.98 mg/mL的标准储备液（甘草酸重量=甘草酸铵重量/1.0207），于-18 ℃下，贮存于密闭的棕色玻璃瓶中。

3.2 系列标准工作液的配制

将甘草酸标准储备液（3.1）用50 %乙醇溶液（1.7）逐级稀释，配制成浓度依次为0.98 μg/mL、4.90 μg/mL、9.80 μg/mL、19.59 μg/mL、48.99 μg/mL、97.97 μg/mL和195.94 μg/mL的甘草酸系列标准工作液。

3.3 供试品溶液的制备

取约0.2 mL市售藿香正气水试样（1.9），置于具塞锥形瓶中，加入甲醇（1.2）25 mL，密塞，称定重量，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）45 min，放冷，再称定重量，用甲醇（1.2）补足减失的重量，摇匀；静置，取上清液用0.22 μm有机相滤膜（2.10）过滤，取续滤液，即得供试品溶液，待测。

同时做空白试验，试样做2次平行，操作步骤同上。

3.4 供试品加标溶液的制备

取约0.2 mL市售藿香正气水试样（1.9），置于具塞锥形瓶中，先准确加入甘草酸标准储备液（3.1）0.2mL，再加入甲醇（1.2）24.8 mL，密塞，称定重量，后续操作步骤同3.3，取续滤液，即得供试品加标溶液，待测。

3.5 色谱条件

a）色谱柱：C₁₈色谱柱，4.6×250 mm，5 μm或者相当的色谱柱；

b）流动相：乙腈（1.3）-0.1%磷酸水溶液（1.6）=34:66（V/V）；

c）流速：1.0 mL/min；

d）进样量：10 μL；

e）洗针液：90 %乙腈水溶液；

f）柱温：35 ℃；

g）检测器及检测波长：检测器为紫外-可见光检测器，检测波长为253 nm。

4 结果

4.1 重复性测试

按照上述色谱条件（3.5）进行采集，甘草酸标准溶液（浓度为19.59 μg/mL）的色谱图如图1所示，积分结果如表1所示。

 

 

图1 甘草酸标准溶液的色谱图

表1 甘草酸标准溶液色谱图积分结果

由表1中数据可知，甘草酸峰的理论塔板数为16062，满足《中国药典（2025年版）》中规定的理论塔板数按甘草酸峰计算不低于5000的要求；对称因子为1.16，具有良好的峰形。

将甘草酸标准溶液（浓度为19.59 μg/mL）连续进样7针，叠加的色谱图如图2所示，结果见表2。

 

图2 甘草酸标准溶液连续进样7针叠加的色谱图

表2 甘草酸标准溶液连续进样7针重复性数据统计

由表2中数据可知，甘草酸标准溶液（浓度为19.59 μg/mL）连续进样7针进行重复性测试，甘草酸峰保留时间的RSD为0.12 %，峰面积的RSD为0.24 %，具有良好的定性定量重复性。

4.2 仪器灵敏度测试

按照上述色谱条件（3.5）进行采集，灵敏度测试的色谱图如图3所示，计算结果见表3。

 

图3 仪器灵敏度的色谱图

表3 仪器灵敏度测试数据

由表3中数据可知，甘草酸的仪器检出限为0.130 μg/mL，仪器定量限为0.432 μg/mL。

4.3 含量测定

4.3.1 校准曲线绘制

按照色谱条件（3.5），将甘草酸系列标准工作液（3.2）上机测定，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制校准曲线，线性方程和确定系数如图4所示。

 

图4 甘草酸的校准曲线

由图4可知，甘草酸在0.98 μg/mL~195.94 μg/mL浓度范围内呈现良好的线性关系，确定系数R²＞0.999。

甘草酸系列标准工作液叠加的色谱图如图5所示。

 

 

图5 甘草酸系列标准工作液叠加的色谱图

4.3.2 试样含量测定

按照色谱条件（3.5），对空白溶液、供试品溶液（3.3）和供试品加标溶液（3.4）进行采集，依据公式（1）计算试样中甘草酸的含量。

式中：----为试样中甘草酸的含量，单位为毫克每毫升（mg/mL）；

C₁----为通过校准曲线得到的供试品溶液中甘草酸的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；

V₁----为试样的定容体积，单位为毫升（mL）；

V₂----为吸取的试样体积，单位为毫升（mL）；

1000----为单位换算系数。

试样中甘草酸的含量结果取2次测定的平均值，计算结果保留3位有效数字。

空白溶液、供试品溶液和供试品加标溶液的色谱图如图6~图8所示。

 

图6 空白溶液的色谱图

 

图7 供试品溶液的色谱图

 

图8 供试品加标溶液的色谱图

依据公式（1）进行计算，市售藿香正气水试样中甘草酸的含量为0.481 mg/mL，满足《中国药典（2025年版）》中规定的藿香正气水每1 mL含甘草浸膏以甘草酸计，不得少于0.48 mg的要求；加标回收实验中，甘草酸的加标回收率为98.4 %。

5 结论

本文使用悟空K2025高效液相色谱仪测定藿香正气水中甘草浸膏的含量。本实验以乙腈和0.1 %磷酸水溶液为流动相，采用反相色谱法，实验结果表明：甘草酸峰的理论塔板数为16062，满足《中国药典（2025年版）》中规定的理论塔板数按甘草酸峰计算不低于5000的要求；对称因子为1.16，具有良好的峰形；甘草酸标准溶液连续进样7针进行重复性测试，保留时间的RSD为0.12 %，峰面积的RSD为0.24 %，具有良好的定性定量重复性；灵敏度测试中，甘草酸的仪器检出限为0.130 μg/mL，仪器定量限为0.432 μg/mL；甘草酸在0.98 μg/mL~195.94 μg/mL浓度范围内呈现良好的线性关系，确定系数R²＞0.999；市售藿香正气水试样中甘草酸的含量为0.481 mg/mL，满足《中国药典（2025年版）》中规定的藿香正气水每1 mL含甘草浸膏以甘草酸计，不得少于0.48 mg的要求；加标回收实验中，甘草酸的加标回收率为98.4 %。因此，悟空 K2025高效液相色谱仪可以满足《中国药典（2025年版）》中对甘草浸膏含量测定的需求。