一 原理

试样经氢氧化钾乙醇溶液皂化，液液萃取净化、浓缩后，一维液相色谱通过C8柱将维生素D与其他杂质分离后，由柱切换阀转入二维液相色谱中，通过C18柱分离维生素D2和D3，经紫外-可见光检测器检测，保留时间定性，外标法定量。

二 结论

本文使用悟空K2025高效液相色谱仪测定蜂蜜试样中维生素D2和维生素D3的含量，实验结果表明：未切阀时，样品只在一维液相上分离，将维生素D和其余物质分开，二维液相色谱图上无峰；切阀后，维生素D进入二维液相系统进行分离，维生素D3与维生素D2的分离度满足要求；维生素D2的理论塔板数为274999，拖尾因子为1.23；维生素D3的理论塔板数为264206，拖尾因子为1.19，均具有良好的峰形；维生素D3与维生素D2之间的分离度为2.10，可实现良好的基线分离；将混合标准溶液连续进样7针进行重复性测试，维生素D2保留时间的RSD为0.03 %，峰面积的RSD为0.80%；维生素D3保留时间的RSD为0.02 %，峰面积的RSD为0.44%，均具有良好的定性定量重复性；灵敏度测试中，维生素D2的仪器检出限为2.218 ng/mL，仪器定量限为7.396 ng/mL；维生素D3的仪器检出限为1.530 μg/mL，仪器定量限为5.102 μg/mL；维生素D2和维生素D3在2.5 ng/mL~100.0 ng/mL浓度范围内均呈现良好的线性关系，确定系数R2均＞0.999；蜂蜜试样中维生素D2和维生素D3均未检出；加标回收实验中，维生素D2和维生素D3的加标回收率分别为83.2 % %和82.1 %。因此，使用悟空 K2025二维高效液相色谱仪可以满足《GB5009.296-2023 食品安全国家标准 食品中维生素D的测定（第二法）》中对蜂蜜中维生素D2和维生素D3含量测定的需求。

三 注意事项

1 维生素D2标准品和维生素D3标准品应冷冻保存；使用时取出，待其恢复室温后使用。

2 维生素D见光易分解，实验过程中应避免紫外光照射。

3 本实验试样的提取净化过程使用的是液液萃取法，若回收率较低，可以增加振荡提取时间，让其提取充分。

4 《GB 5009.296-2023 食品安全国家标准 食品中维生素D的测定（第二法）》中10.2.6 “甲醇-水溶液（1+19）：将甲醇和水按照19:1的体积比混合均匀，超声脱气”中存在错误，应为“将甲醇和水按照1:19的体积比混合均匀，超声脱气”。

5 二维液相系统上维生素D2和维生素D3分离时，使用标准中指定的色谱柱，若按照《GB 5009.296-2023 食品安全国家标准食品中维生素D的测定（第二法）》中流动相及梯度表进行实验，维生素D2和维生素D3的灵敏度较低，为了提高检出能力，将流动相更换成100%甲醇，使维生素D2和维生素D3的出峰提前。

6 《GB 5009.296-2023 食品安全国家标准 食品中维生素D的测定（第二法）》附录C中，在线柱切换-液相色谱系统流路示意图中b）阀切换VD富集状态示意图存在错误，正确示意图如下图所示：